Il luogo in cui sorge la Catacomba di San Sebastiano era anticamente una profonda depressione, utilizzata come cava di pozzolana e chiamata ad catacumbas (ovvero “vicino alle cavità”), nome che è diventato sinonimo di cimitero sotterraneo.

Fin dal I secolo, il sito è stato intensamente sfruttato e costruito: le gallerie sotterranee sono state riutilizzate per ricavare loculi; in superficie, invece, sono stati costruiti diversi colombari e almeno due sistemi residenziali (la cosiddetta villa piccola e la villa grande) dotati di notevoli decorazioni pittoriche parietali.

Intorno alla metà del II secolo, il fondo della valle fu interrato per creare una piazzola, su un lato della quale furono costruiti in successione tre mausolei (da Clodio Ermete, dagli Innocentiores, dagli Ax).

Un ulteriore interramento dell'area fu fatto per dare spazio alla costruzione dei triclia, un portico delimitato da un muro su cui sono presenti numerosi graffiti di invocazione rivolti alle SS. Pietro e Paolo, che vennero venerati insieme in questo luogo intorno al 250.

Sul sito, quindi, l'imperatore Costantino (306-337) fece costruire una basilica a forma di circo romano (chiamata “circiforme”).

Nel frattempo, già nel III secolo, la catacomba che ospitava le tombe dei martiri Sebastiano ed Eutichio iniziò a svilupparsi nel sottosuolo.